Обтяжка

Центрифугирование метод исследования. Препаративное центрифугирование

03.01.2020

Метод замораживания-скалывания

Принципиально новые возможности электронной микроскопии открылись сравнительно недавно, после разработки метода «замораживания – скалывания». С помощью этого метода исследуются тончайшие детали строения клетки, при этом получается объемное изображение в трансмиссионном электронном микроскопе.

При обычном замораживании в клетках образуются кристаллики льда, которые заметно искажают их структуру. Во избежание этого клетки замораживают очень быстро при температуре жидкого азота (-196С). При таком мгновенном замораживании кристаллы льда не успевают образоваться, и клетка не испытывает деформаций.

Замороженный блок раскалывают лезвием ножа (отсюда и название метода). Затем, обычно в вакуумной камере, избыток льда удаляют возгонкой. Эта операция называется травлением. После травления более резко обозначается рельеф в плоскости скола. Полученный образец оттеняется, то есть на поверхность образца напыляется тонкий слой тяжелых металлов. Однако весь фокус состоит в том, что напыление производится под углом к поверхности образца. Это очень важный момент. Появляется эффект тени, изображение выглядит объемным.

В трансмиссионном микроскопе электронный луч способен проникнуть только через очень тонкие срезы. Обычная толщина оттененных образцов чрезмерно велика, поэтому органическую материю, подстилающую слой металла, необходимо растворить. В результате остается тонкая металлическая реплика (или отпечаток) с поверхности образца. Реплику и используют в трансмиссионном микроскопе.

Этот метод предоставил, например, уникальную возможность наблюдать внутреннее строение мембран клетки.

Дифференциальное центрифугирование

Помимо микроскопии, другим основным и широко распространенным методом изучения клеток является дифференциальное центрифугирование или фракционирование.

Принцип метода состоит в том, что при центрифугировании развивается центробежная сила, под воздействием которой взвешенные частицы оседают на дно центрифужной пробирки.

После того, как в начале 40-х годов начали использовать ультрацентрифугу, разделение клеточных компонентов стало вполне реальным.

Прежде, чем подвергнуть клетки центрифугированию, их необходимо разрушить – разрушить жесткий каркас клеточных оболочек. Для этого используют различные методы: ультразвуковую вибрацию, продавливание через маленькие отверстия или самое обычное измельчение растительных тканей пестиком в фарфоровой ступе. При осторожном применении методов разрушения можно сохранить некоторые органеллы целыми.

При высокоскоростном центрифугировании крупные компоненты клетки (например, ядра) быстро оседают (седиментируют), при относительно низких скоростях и образуют осадок на дне центрифужной пробирки. При более высоких скоростях в осадок выпадают более мелкие компоненты, такие как хлоропласты и митохондрии.

То есть при центрифугировании компоненты клетки распадаются на фракции: крупные и мелкие, поэтому второе название метода? фракционирование. При этом, чем выше скорость и длительность цетрифугирования, тем мельче полученная фракция.

Скорость седиментации (осаждения) компонентов выражается с помощью коэффициента седиментации, обозначаемого S.

Этапы дифференциального центрифугирования: низкая скорость (ядра, цитоскелет), средняя скорость (хлоропласты), высокая скорость (митохондрии, ризосомы, микротельца), очень высокая скорость (рибосомы).

Фракционированные клеточные экстракты, называемые также бесклеточными системами, широко используются для изучения внутриклеточных процессов. Только работая с бесклеточными экстрактами, можно установить детальный молекулярный механизм биологических процессов. Так, использование именно этого метода принесло триумфальный успех в изучении биосинтеза белка.

Ну и вообще, чистые фракции внутриклеточных структур можно подвергать любым видам анализа.

Метод культуры клеток

Клетки животных, выделенные в культуру (то есть помещенные на питательную среду), погибают после определенного числа делений, поэтому считаются трудным и неудобным объектом для культивирования. Другое дело клетки растений, способные делиться неограниченное число раз.

Метод культуры клеток облегчает изучение механизмов клеточной дифференциации у растений.

На питательной среде клетки растений образуют однородную недифференцированную клеточную массу- каллус. Каллус обрабатывают гормонами. Под влиянием гормонов клетки каллуса могут давать начало разным органам.



Мы как раз начали применять еще новый в то время метод дифференциального центрифугирования. Он сводится к тому, что клетки разрушают в гомогенизаторе, а затем центрифугируют при последовательно возрастающих скоростях, после чего получают несколько фракций, состоящих из разных органелл (рис. 1.) Выделенные таким путем органеллы все еще сохраняют многие из своих функциональных свойств, которые можно затем изучить посредством биохимических методов. Наша задача состояла в том, чтобы установить местонахождение в этих фракциях некоторых ферментов, участвующих в обмене углеводов в печени крысы, и тем самым выяснить, с какими клеточными структурами связаны эти ферменты. Как правило, мы проверяли сначала гомогенат клеток на присутствие данного фермента, а затем искали его во фракциях. Среди прочих ферментов мы работали с так называемой кислой фосфатазой. Этот фермент, отщепляющий неорганический фосфат от ряда фосфорных эфиров, не связан непосредственно с углеводным обменом. В основном он служил нам в качестве контроля.

К нашему удивлению, активность кислой фосфатазы в гомогенате была в 10 раз меньше той величины, которую следовало ожидать на основании предыдущих анализов препаратов, подвергнутых более основательному разрушению в смесителе Уоринга. Суммарная активность всех фракций хотя и превышала вдвое активность гомогената, но все-таки была в 5 раз меньше ожидаемой величины. Когда через пять дней мы повторили определения на тех же фракциях (которые хранили все время в холодильнике), то оказалось, что активность фермента значительно возросла во всех отдельных фракциях, а особенно во фракции, содержащей митохондрии. Теперь суммарная активность уже достигла ожидаемой величины.

К счастью, мы устояли перед искушением отбросить первую серию данных как результат технической ошибки. Мы провели несколько дополнительных опытов и быстро получили ключ к разгадке тайны. В живых клетках фермент в основном (или даже полностью) заключен внутри небольших мешочкоподобных частиц. Поверхностная мембрана этихчастиц не только способна удерживать фермент внутри частицы, но и препятствует проникновению извне тех мелких молекул фосфорных эфиров, с которыми мы работали. Активность, измеренная в наших опытах, характеризовала лишь ту небольшую часть фермента, которая либо находилась в клетке в свободном состоянии, либо освободилась из частиц, поврежденных в ходе опыта. Смеситель Уоринга практически разрушает все частицы; при более мягкой обработке в гомогенизаторе, которую мы применили в наших исследованиях, разрушается лишь около 10% частиц. Этим и объясняется низкая первоначальная активность фермента в гомогенате. Дальнейшее фракционирование приводит к возрастанию суммарной активности во фракциях еще на 10%. Остальная часть фермента освобождается в результате старения частиц при хранении их в течение пяти дней в холодильнике.

TBegin-->TEnd-->

Рис. 1. Дифференциальное центрифугирование позволяет разделить клетки на фракции, состоящие из различных клеточных компонентов. Быстрое механическое вращение пестика разрушает клетки, вызывая освобождение их содержимого в окружающую среду. Гомогенат подвергается последовательному центрифугированию при разных скоростях. Метод, разработанный В. Шнайдером, включает этапы 1—8. Автор и его сотрудники ввели этапы 9 и 10. Фракция митохондрий (6 этап) осаждается после центрифугирования при 25 000 g в течение 10 мин. Числа, характеризующие градиент плотности сахарозы, показывают удельный вес (г/см3).


Курсовая работа

Центрифугирование

1. Принцип метода

Разделение веществ с помощью центрифугирования основано на разном поведении частиц в центробежном поле. Суспензию частиц, помещенную в пробирку, загружают в ротор, установленный на валу привода центрифуги.

В центробежном поле частицы, имеющие разную плотность, форму или размеры, осаждаются с разной скоростью. Скорость седиментации зависит от центробежного ускорения, прямо пропорционального угловой скорости ротора и расстоянию между частицей и осью вращения:

а центробежное ускорение тогда будет равно)

Поскольку один оборот ротора составляет 2п радиан, угловую скорость ротора в оборотах в минуту можно записать так:

Центробежное ускорение обычно выражается в единицах g и называется относительное центробежное ускорение , т. е.

При перечислении условий разделения частиц указывают скорость вращения и радиус ротора, а также время центрифугирования. Центробежное ускорение обычно выражают в единицах g , рассчитанных из среднего радиуса вращения столбика жидкости в центрифужной пробирке. На основании уравнения Доулом и Котциасом была составлена номограмма, выражающая зависимость ОЦУ от скорости вращения ротора и радиуса г.

Скорость седиментации сферических частиц зависит не только от центробежного ускорения, но и от плотности и радиуса самих частиц и от вязкости среды суспендирования. Время, необходимое для осаждения сферической частицы в жидкой среде от мениска жидкости до дна центрифужной пробирки, обратно пропорционально скорости седиментации и определяется следующим уравнением:

где t -- время седиментации в секундах, rj -- вязкость среды, г ч --радиус частицы, р ч --плотность частицы, р -- плотность среды, г м -- расстояние от оси вращения до мениска жидкости, г д -- расстояние от оси вращения до дна пробирки.

Как следует из уравнения, при заданной скорости вращения ротора время, необходимое для осаждения гомогенных сферических частиц, обратно пропорционально квадрату их радиусов и разности плотностей частиц и среды и прямо пропорционально вязкости среды. Поэтому смесь гетерогенных, приблизительно сферических частиц, различающихся по плотности и размерам, можно разделить либо за счет разного времени осаждения их на дно пробирки при данном ускорении, либо за счет распределения седиментирующих частиц вдоль пробирки, устанавливающегося через определенный промежуток времени. При разделении веществ необходимо учитывать и такие важные факторы, как плотность и вязкость среды. Описанными методами можно разделять клеточные органеллы из гомогенатов тканей. Основные компоненты клетки осаждаются в следующей последовательности: сначала целые клетки и их фрагменты, затем ядра, хлоропласты, митохондрии, лизосомы, микросомы и, наконец, рибосомы. Осаждение несферических частиц не подчиняется уравнению, поэтому частицы одинаковой массы, но различной формы осаждаются при разных скоростях. Эта особенность используется при исследовании с помощью ультрацентрифугирования конформации макромолекул.

заключается в выделении биологического материала для последующих биохимических исследований. При этом можно брать большие количества исходного биологического материала, например посевы микробных клеток из периодических или непрерывных культур, а также посевы растительных и животных клеток из культур ткани и плазмы крови. С помощью препаративного центрифугирования выделяют большое количество клеточных частиц для изучения их морфологии, структуры и биологической активности. Метод применяется также для выделения таких биологических макромолекул, как ДНК и белки из предварительно очищенных препаратов.

Аналитическое центрифугирование применяется главным образом для изучения чистых или практически чистых препаратов макромолекул или частиц, например рибосом. В данном случае используется небольшое количество материала, а седиментация исследуемых частиц непрерывно регистрируется с помощью специальных оптических систем. Метод позволяет получать данные о чистоте, молекулярном весе и структуре материала. В практикумах для студентов препаративное центрифугирование применяется гораздо чаще, чем аналитическое, поэтому мы остановимся на нем более подробно, хотя в основе обоих методов лежат общие принципы.

2. Препаративное центрифугирование

2.1 Дифференциальное центрифугирование

Этот метод основан на различиях в скоростях седиментации частиц, отличающихся друг от друга размерами и плотностью. Разделяемый материал, например гомогенат ткани, центрифугируют при ступенчатом увеличении центробежного ускорения, которое выбирается так, чтобы на каждом этапе на дно пробирки осаждалась определенная фракция. В конце каждой стадии осадок отделяют от надосадочной жидкости и несколько раз промывают, чтобы в конечном итоге получить чистую осадочную фракцию. К сожалению, получить абсолютно чистый осадок практически невозможно; чтобы понять, почему это происходит, обратимся к рассмотрению процесса, происходящего в центрифужной пробирке в начале каждой стадии центрифугирования.

Сначала все частицы гомогената распределены по объему центрифужной пробирки равномерно, поэтому получить чистые препараты осадков самых тяжелых частиц за один цикл центрифугирования невозможно: первый образовавшийся осадок содержит в основном самые тяжелые частицы, но, кроме этого, также некоторое количество всех исходных компонентов. Получить достаточно чистый препарат тяжелых частиц можно лишь при повторном суспендировании и центрифугировании исходного осадка. Дальнейшее центрифугирование супернатанта при последующем увеличении центробежного ускорения приводит к седиментации частиц средних размеров и плотности, а затем и к осаждению самых мелких частиц, имеющих наименьшую плотность. На рис. 2.3 изображена схема фракционирования гомогената печени крысы.

Дифференциальное центрифугирование является, по-видимому, самым распространенным методом выделения клеточных органелл из гомогенатов тканей. Наиболее успешно применяется этот метод для разделения таких клеточных органелл, которые значительно отличаются друг от друга по размерам и плотности. Но даже и в этом случае получаемые фракции никогда не бывают абсолютно гомогенными, и для их дальнейшего разделения применяют другие методы, описанные ниже. Эти методы, основанные на различиях в плотности органелл, обеспечивают более эффективное разделение благодаря тому, что центрифугирование осуществляют в растворах с непрерывным или ступенчатым градиентом плотности. Недостатком этих методов является то, что приходится тратить время на получение градиента плотности раствора.

2.2 Зонально-скоростное центрифугирование

Метод зонально-скоростного, или, как его еще называют, s-зонального центрифугирования, заключается в наслаивании исследуемого образца на поверхность раствора с непрерывным градиентом плотности. Затем образец центрифугируют до тех пор, пока частицы не распределятся вдоль градиента в виде дискретных зон или полос. Благодаря созданию градиента плотности удается избежать смешивания зон, возникающего в результате конвекции. Метод зонально-скоростного центрифугирования применяется для разделения гибридов РНК--ДНК, субъединиц рибосом и других клеточных компонентов.

2.3 Изопикническое центрифугирование

Изопикническое центрифугирование проводят как в градиенте плотности, так и обычным путем. Если центрифугирование проводится не в градиенте плотности, препарат сначала центрифугируют так, чтобы осели частицы, молекулярный вес которых больше, чем у исследуемых частиц. Эти тяжелые частицы отбрасывают, и образец суспендируют в среде, плотность которой такая же, как и у фракции, которую хотят выделить, а затем центрифугируют до тех пор, пока исследуемые частицы не осядут на дно пробирки, а частицы меньшей плотности не всплывут на поверхность жидкости..

Другой способ заключается в наслаивании образца на поверхность раствора с непрерывным градиентом плотности, охватывающим диапазон плотностей всех компонентов смеси. Центрифугирование проводят до тех пор, пока плавучая плотность частиц не сравняется с плотностью соответствующих зон, т. е. пока не произойдет разделение частиц по зонам. Метод получил название зонально-изопикнического, или резонального центрифугирования, так как основным моментом здесь является плавучая плотность, а не размеры или форма частиц. На величину плотности, при которой частицы образуют изопикнические полосы, влияет природа среды суспендирования; частицы могут быть проницаемыми для одних соединений, находящихся в растворе, и непроницаемыми для других или же присоединять молекулы раствора. При использовании зонального ротора митохондрии, лизосомы, пероксисомы и микросомы концентрируются в полосах с 42%, 47%, 47% и 27%-ной сахарозой, соответствующих плотности 1,18, 1,21, 1,21 и 1,10 г-см -3 соответственно. Плотность субклеточных органелл зависит также и от избирательного поглощения ими определенных соединений. Введение крысам не вызывающего гемолиз детергента тритона WR-1339 приводит ^увеличению размеров и уменьшению плотности лизосом печени; плотность митохондрий и пероксисом остается без изменений. Несмотря на то что седиментационные свойства лизосом при этом, как правило, не меняются, их равновесная плотность в градиенте сахарозы понижается с 1,21 до 1,1, что приводит к соответствующему разделению лизосомально-пероксисомальной фракции. Эта особенность используется при количественном разделении лизосом, митохондрий и пероксисом, основанном на удалении из гомогенной среды всех частиц с большей, чем у микросом, плотностью и последующем изопикническом центрифугировании выпавших в осадок тяжелых частиц.

2.4 Равновесное центрифугирование в градиенте плотности

Для создания градиента плотности используют соли тяжелых металлов, например рубидия или цезия, а также растворы сахарозы. Образец, например, ДНК, смешивают с концентрированным раствором хлористого цезия. И растворенное вещество, и растворитель сначала распределяются по всему объему равномерно. В ходе центрифугирования устанавливается равновесное распределение концентрации, а следовательно, и плотности CsCl, так как ионы цезия обладают большой массой. Под действием центробежного ускорения молекулы ДНК перераспределяются, собираясь в виде отдельной зоны в части пробирки с соответствующей им плотностью. Метод применяется главным образом в аналитическом центрифугировании и был использован Мезельсоном и Сталем для изучения механизма репликации ДНК Е. coli . Равновесное центрифугирование в градиенте плотности является также одним из методов разделения и изучения липопротеидов плазмы крови человека.

2.5 Формирование и извлечение градиентов

2.5.1 Природа градиентов

Для создания градиентов плотности растворов чаще всего применяются растворы сахарозы, иногда с фиксированным рН. В некоторых случаях хорошее разделение получается при использовании вместо обычной воды D 2 0. В табл. 2.1 приведены свойства некоторых растворов сахарозы.

Выбор градиента диктуется конкретными задачами фракционирования. Так, например, фикол, выпускаемый фирмой Pharmacia Fine Chemicals, может заменять сахарозу в тех случаях, когда необходимо создать градиенты с большой плотностью и низким осмотическим давлением. Еще одно преимущество фикола состоит в том, что он не проходит через клеточные мембраны. Для создания градиентов большей плотности применяют соли тяжелых металлов, например рубидия и цезия, однако из-за коррозирующего действия CsCl такие градиенты используются только в роторах, изготовленных из стойких металлов, например титана»

2.5.2 Методика создания ступенчатого градиента плотности

Для создания градиента плотности в центрифужную пробирку осторожно вносят при помощи пипетки несколько растворов с последовательно уменьшающейся плотностью. Затем на самый верхний слой, имеющий наименьшую плотность, наслаивают образец в виде узкой зоны, после чего пробирку центрифугируют. Получить плавные линейные градиенты можно за счет сглаживания ступенчатых градиентов при длительном стоянии раствора. Процесс можно ускорить, осторожно перемешивая содержимое пробирки проволокой или слегка покачивая пробирку.

2.5.3 Методика создания плавного градиента плотности

В большинстве случаев для создания плавного градиента плотности пользуются специальным устройством. Оно состоит из двух цилиндрических сосудов строго определенного одинакового диаметра, сообщающихся друг с другом в нижней части с помощью стеклянной трубки с контрольным клапаном, что позволяет регулировать пропорции, в которых смешивается содержимое обоих сосудов. Один из них снабжен мешалкой и имеет выходное отверстие, через которое раствор стекает в центрифужные пробирки. Более плотный раствор помещают в смеситель; второй цилиндр заполняют раствором меньшей плотности. Высота столбика растворов в обоих цилиндрах устанавливается таким образом, чтобы гидростатическое давление в них было одинаковым. Более плотный раствор постепенно выпускается из смесителя в центрифужные пробирки и одновременно замещается равным объемом раствора меньшей плотности, поступающего в смеситель из второго цилиндра через контрольный клапан. Гомогенность раствора в смесителе обеспечивается за счет постоянного перемешивания раствора с помощью мешалки. По мере сливания раствора в центрифужные пробирки плотность его уменьшается и в пробирках создается линейный градиент плотности. Нелинейные градиенты можно создавать при помощи системы, состоящей из двух цилиндров неодинакового диаметра.

Для формирования градиентов плотности различной крутизны пользуются системой из двух механически управляемых шприцов, которые заполняют растворами неодинаковой плотности. Различные градиенты можно создавать, изменяя относительную скорость движения поршней.

2.5.4 Извлечение градиентов из центрифужных пробирок

После завершения центрифугирования и разделения частиц необходимо извлечь образовавшиеся зоны. Это делают несколькими способами, чаще всего методом вытеснения. Центрифужную пробирку прокалывают у основания и в нижнюю ее часть медленно вводят очень плотную среду, например 60--70%-ный раствор сахарозы. Находящийся сверху раствор вытесняется, и фракции отбирают при помощи шприца, пипетки или специального приспособления, соединенного через трубочку с коллектором фракций. Если пробирки изготовлены из целлулоида или нитроцеллюлозы, фракции извлекают, надрезав пробирку специальным лезвием. Для этого центрифужную пробирку, закрепленную в штативе, надрезают непосредственно под нужной зоной и отсасывают фракцию шприцом или пипеткой. При подходящей конструкции режущего устройства потеря раствора будет минимальной. Сбор фракций осуществляют также, проколов основание пробирки тонкой полой иглой. Капли, вытекающие из пробирки через иглу, собирают в коллектор фракций для дальнейшего анализа.

2.5.5 Препаративные центрифуги и их применение

Препаративные центрифуги можно подразделить на три основные группы: центрифуги общего назначения, скоростные центрифуги и препаративные ультрацентрифуги. Центрифуги общего назначения дают максимальную скорость 6000 об * мин -1 и ОЦУ до 6000 g . Они отличаются друг от друга только емкостью и имеют ряд сменных роторов: угловых и с подвесными стаканами. Одной из особенностей этого вида центрифуг является их большая емкость -- от 4 до 6 дм 3 , что позволяет загружать их не только центрифужными пробирками на 10,50 и 100 см 3 , но и сосудами емкостью до 1,25 дм 3 . Во всех центрифугах этого типа роторы жестко крепятся на валу привода, и центрифужные пробирки вместе с их содержимым должны быть тщательно уравновешены и различаться по весу не более чем на 0,25 г. Нельзя загружать в ротор нечетное число пробирок, а при неполной загрузке ротора пробирки следует размещать симметрично, одна против другой, обеспечивая таким образом равномерное распределение пробирок относительно оси вращения ротора.

Скоростные центрифуги дают предельную скорость 25 000 об-мин -1 и ОЦУ до 89000g. Камера ротора снабжена системой охлаждения, предотвращающей нагревание, которое возникает вследствие трения при вращении ротора. Как правило, скоростные центрифуги имеют емкость 1,5 дм 3 и снабжены сменными роторами, как угловыми, так и с подвесными стаканами.

Препаративные ультрацентрифуги дают предельную скорость до 75000 об-мин -1 и максимальное центробежное ускорение 510 000 g . Они снабжены как холодильником, так и вакуумной установкой, чтобы предотвратить перегрев ротора вследствие трения его о воздух. Роторы таких центрифуг изготавливают из высокопрочных алюминиевых или титановых сплавов. В основном применяют роторы из алюминиевых сплавов, однако в тех случаях, когда необходимы особенно высокие скорости, пользуются роторами из титана. Для уменьшения вибрации, возникающей в результате нарушения равновесия ротора из-за неравномерного наполнения центрифужных пробирок, ультрацентрифуги имеют гибкий вал. Центрифужные пробирки и их содержимое должны быть тщательно уравновешены с точностью до 0,1 г. Аналогичные требования следует соблюдать и при загрузке роторов центрифуг общего назначения.

2.6 Конструкция роторов

2.6.1 Угловые роторы и роторы с подвесными стаканами

Роторы препаративных центрифуг обычно бывают двух типов -- угловые и с подвесными стаканами. Угловыми они называются потому, что помещаемые в них центрифужные пробирки все время находятся под определенным углом к оси вращения. В роторах с подвесными стаканами пробирки устанавливаются вертикально, а при вращении под действием возникающей центробежной силы переходят в горизонтальное положение; угол наклона к оси вращения составляет 90°.

В угловых роторах расстояние, проходимое частицами до соответствующей стенки пробирки, весьма невелико, и поэтому седиментация происходит сравнительно быстро. После столкновения со стенками пробирки частицы соскальзывают вниз и образуют на дне осадок. При центрифугировании возникают конвекционные потоки, которые в значительной степени затрудняют разделение частиц с близкими седиментационными свойствами. Тем не менее роторы подобной конструкции с успехом применяются для разделения частиц, скорости седиментации которых различаются довольно сильно.

В роторах с подвесными стаканами также наблюдаются конвекционные явления, однако выражены они не так сильно. Конвекция является результатом того, что под действием центробежного ускорения частицы оседают в направлении, не строго перпендикулярном оси вращения, и поэтому, как и в угловых роторах, ударяются о стенки пробирки и соскальзывают на дно.

Конвекционных явлений и эффектов завихрения удается до некоторой степени избежать, используя пробирки секториальной формы в роторах с подвесными стаканами и регулируя скорость вращения ротора; перечисленных выше, недостатков лишен также метод центрифугирования в градиенте плотности.

2.6.2 Роторы непрерывного действия

Роторы непрерывного действия предназначены для скоростного фракционирования относительно небольших количеств твердого материала из суспензий больших объемов, например для выделения клеток из питательных сред. В ходе центрифугирования суспензия частиц добавляется в ротор непрерывно; пропускная способность ротора зависит от природы осаждаемого препарата и варьируете пределах от 100 см 3 до 1 дм 3 в 1 мин. Особенность ротора состоит в том, что он представляет собой изолированную камеру специальной конструкции; содержимое ее не сообщается с внешней средой, а поэтому не загрязняется и не распыляется.

2.6.3 Зональные роторы, или роторы Андерсона

Зональные роторы делают из алюминиевых или титановых сплавов, которые способны выдерживать весьма значительные центробежные ускорения. Обычно в них имеется цилиндрическая полость, закрывающаяся съемной крышкой. Внутри полости, на оси вращения расположена осевая трубка, на которую надевается насадка с лопастями, разделяющими полость ротора на четыре сектора. Лопасти или перегородки имеют радиальные каналы, по которым из осевой трубки к периферии ротора нагнетается градиент. Благодаря такой конструкции лопастей конвекция сведена до минимума.

Заполнение ротора производится при его вращении со скоростью около 3000 об/мин - 1 . В ротор нагнетают заранее созданный градиент, начиная со слоя наименьшей плотности, который равномерно распределяется по периферии ротора и удерживается у внешней его стенки перпендикулярно оси вращения благодаря центробежной силе. При последующем добавлении слоев градиента большей плотности происходит непрерывное смещение к центру менее плотных слоев. После того как в ротор будет нагнетен весь градиент, его заполняют до полного объема раствором, называемым «подушкой», плотность которого совпадает или несколько превышает наибольшую плотность преформированного градиента.

Затем через осевую трубку, наслаивают исследуемый образец, который вытесняют из трубки в объем ротора с помощью раствора меньшей плотности, при этом с периферии удаляется такой же объем «подушки». После всех этих процедур скорость вращения ротора доводят до рабочей и в течение необходимого промежутка времени проводят либо зонально-скоростное, либо зонально-изопикническое фракционирование. Извлечение фракций проводят при скорости вращения ротора 3000 об - мин -1 . Содержимое ротора вытесняют путем добавления с периферии «подушки», в первую очередь вытесняются менее плотные слои. Благодаря особой конструкции осевого канала ротора Андерсона смешивания зон при их вытеснении не происходит. Выходящий градиент пропускают через регистрирующее устройство, например ячейку спектрофотометра, с помощью которого по поглощению при 280 нм можно определить содержание белка, или через специальный детектор радиоактивности, после чего собирают фракции.

Емкость зональных роторов, используемых при средних скоростях, варьирует от 650 до 1600 см 3 , что позволяет получать довольно большое количество материала. Зональные роторы применяются для удаления белковых примесей из различных препаратов и для выделения и очистки митохондрий, лизосом, полисом и белков.

2.6.4 Анализ субклеточных фракций

Свойства полученного при фракционировании препарата субклеточных частиц можно отнести к свойствам самих частиц только в том случае, если препарат не содержит примесей. Следовательно, всегда необходимо оценивать чистоту получаемых препаратов. Эффективность гомогенизации и наличие в препарате примесей можно определить с помощью микроскопического исследования. Однако отсутствие видимых примесей еще не является достоверным доказательством чистоты препарата. Для количественной оценки чистоты полученный препарат подвергают химическому анализу, который позволяет установить содержание в нем белков или ДНК, определить его ферментативную активность, если возможно, и иммунологические свойства.

Анализ распределения ферментов во фракционируемых тканях основан на двух общих принципах. Первый из них заключается в том, что все частицы данной субклеточной популяции содержат одинаковый набор ферментов. Второй предполагает, что каждый фермент локализован в каком-то определенном месте внутри клетки. Если бы это положение было верно, то ферменты могли бы выступать в роли маркеров для соответствующих органелл: например, цито-хромоксидаза и моноаминооксидаза служили бы ферментами-маркерами митохондрий, кислые гидролазы -- маркерами лизосом, каталаза -- маркером пероксисом, а глюкозо-6-фосфатаза -- маркером мембран микросом. Оказалось, однако, что некоторые ферменты, например малатдегидрогеназа, Р -глюкуронидаза, НАДФ" Н-цитохром-с-редуктаза, локализованы более чем в одной фракции. Поэтому к выбору ферментов-маркеров субклеточных фракций в каждом конкретном случае следует подходить с большой осторожностью. Более того, отсутствие фермента-маркера еще не означает отсутствия соответствующих органелл. Вполне вероятно, что при фракционировании происходит потеря фермента органеллами или он ингибируется или инактивируется; поэтому для каждой фракции обычно определяют не менее двух ферментов-маркеров.

Фракция

Объем, см"

Общее разведение

Экснюк-ция, 660 нм

Единицы активности фермента

Выход активности во фракции, %

2.7 Фракционирование методом дифференциального центрифугирования

2.7.1 Оформление результатов

Результаты, полученные при фракционировании тканей, удобнее всего оформлять в виде графиков. Так, при исследовании распределения ферментов в тканях данные лучше всего представлять в виде гистограмм, дающих возможность визуально оценить результаты проведенных экспериментов.

Ферментативную активности содержание белка в пробе определяют как в исходном гомогенате, так и в каждой выделенной субклеточной фракции в отдельности. Суммарная ферментативная активность и содержание белка во фракциях не должны сильно отличаться от соответствующих значений в исходном гомогенате.

Затем проводят расчет ферментативной активности и содержания белка в каждой фракции в % от общего выхода, на основании чего составляют гистограмму. По оси абсцисс последовательно откладывают относительное количество_ белка в каждой фракции в порядке их выделения, а по оси ординат -- относительную удельную активность каждой фракции. Таким образом, по площади столбиков определяют ферментативную активность каждой фракции.

2.7.2 Аналитическое ультрацентрифугирование

В отличие от препаративного центрифугирования, целью которого является разделение веществ и их очистка, аналитическое ультрацентрифугирование применяется в основном для изучения седиментационных свойств биологических макромолекул и других структур. Поэтому в аналитическом центрифугировании применяют роторы и регистрирующие системы особой конструкции: они позволяют непрерывно наблюдать за седиментацией материала в центробежном поле.

Аналитические ультрацентрифуги могут развивать скорость до 70 000 об-мин -1 , создавая при этом центробежное ускорение до 500 000 g . Ротор у них, как правило, имеет форму эллипсоида и соединен посредством струны с мотором, что позволяет варьировать скорость вращения ротора. Вращается ротор в вакуумной камере, снабженной холодильным устройством, и имеет две ячейки, аналитическую и балансировочную, которые устанавливаются в центрифуге строго вертикально, параллельно оси вращения. Балансировочная ячейка служит для уравновешивания аналитической и представляет собой металлический блок с прецизионной системой. В ней имеются также два индексных отверстия, находящиеся на строго определенном расстоянии от оси вращения, с помощью которых определяют соответствующие расстояния в аналитической ячейке. Аналитическая ячейка, емкость которой, как правило, равна 1 см 3 , имеет секториальную форму. При правильной установке в роторе она, несмотря на то что стоит вертикально, работает по тому же принципу, что и ротор с подвесными стаканами, создавая почти идеальные условия седиментации. На торцах аналитической ячейки имеются окошки с кварцевыми стеклами. Аналитические ультрацентрифуги снабжены оптическими системами, позволяющими наблюдать за седиментацией частиц в течение всего периода центрифугирования. Через заданные промежутки времени седиментирующий материал можно фотографировать. При фракционировании белков и ДНК за седиментацией наблюдают по поглощению в ультрафиолете, а в тех случаях, когда исследуемые растворы имеют разные коэффициенты преломления -- с помощью шлирен-системы или интерференционной системы Рэлея. Два последних метода основаны на том, что при прохождении света через прозрачный раствор, состоящий из зон с различной плотностью, на границе зон происходит преломление света. При седиментации между зонами с тяжелыми и легкими частицами образуется граница, которая действует как преломляющая линза; при этом на фотопластинке, использующейся в качестве детектора, появляется пик. В ходе седиментации происходит перемещение границы, а следовательно, и пика, по скорости передвижения которого можно судить о скорости седиментации материала. Интерферометрические системы отличаются большей чувствительностью, чем шлирен-системы. Аналитические ячейки бывают односекторные, которые применяются наиболее часто, и двухсекторные, которые используются для сравнительного изучения растворителя и растворенного вещества.

В биологии аналитическое ультрацентрифугирование применяется для определения молекулярных весов макромолекул, проверки чистоты получаемых образцов, а также для исследования конформационных изменений в макромолекулах.

2.8 Применение аналитического ультрацентрифугирования

2.8.1 Определение молекулярных весов

Существует три основных метода определения молекулярных весов при помощи аналитического ультрацентрифугирования: определение скорости седиментации, метод седиментациоиного равновесия и метод приближения к седиментационному равновесию.

Определение молекулярного веса по скорости седиментации -- это наиболее распространенный метод. Центрифугирование проводят при больших скоростях, так что частицы, вначале равномерно распределенные по всему объему, начинают упорядочение перемещаться по радиусу от центра вращения. Между областью растворителя, уже свободной от частиц, и той его частью, которая их содержит, образуется четкая граница раздела. Эта граница при центрифугировании перемещается, что дает возможность определять скорость седиментации частиц при помощи одного из вышеупомянутых методов, регистрируя это перемещение на фотопластинке.

Скорость седиментации определяется следующим соотношением:

где х -- расстояние от оси вращения в см,

t -- время в с,

w -- угловая скорость в рад-с -1 ,

s --коэффициент седиментации "молекулы.

Коэффициент седиментации -- это скорость, отнесенная к единице ускорения, его измеряют в единицах Сеедберга ; 1 единица Сведберга равна 10 _13 с. Численное значение s зависит от молекулярного веса и формы частиц и является величиной, характерной для данной молекулы или надмолекулярной структуры. Например, коэффициент седиментации лизоцима равен 2,15 S; катал аза имеет коэффициент седиментации 11.35S, субъединицы рибосом бактерий -- от 30 до 50S, а субъединицы рибосом эукариотов -- от 40 до 60S.

где М -- молекулярный вес молекулы, R -- газовая постоянная, Т -- абсолютная температура, s -- коэффициент седиментации молекулы, D -- коэффициент диффузии молекулы, v -- парциальный удельный объем, который можно рассматривать как объем, занимаемый одним граммом растворенного вещества, р -- плотность растворителя.

Метод седиментациоиного равновесия. Определение молекулярных весов этим методом проводится при сравнительно небольших скоростях вращения ротора, порядка 7 000--8 000 об-мин -1 , чтобы молекулы с большим молекулярным весом не осаждались на дно. Ультрацентрифугирование проводят вплоть до достижения частицами равновесия, устанавливающегося под действием центробежных сил, с одной стороны, и диффузионных -- с другой, т. е. до тех пор, пока частицы не перестанут перемещаться. Затем по образовавшемуся градиенту концентрации рассчитывают молекулярный вес вещества "согласно формуле

где R -- газовая постоянная, Т -- абсолютная температура, ю -- угловая скорость, р -- плотность растворителя, v -- парциальный удельный объем, с х и с 2 -- концентрация растворенного вещества на расстояниях г г и г 2 от оси вращения.

Недостатком данного метода является то, что для достижения седиментациоиного равновесия необходимо длительное время -- от нескольких дней до нескольких недель при непрерывной работе центрифуги.

Метод приближения к седиментационному равновесию былразработан для того, чтобы избавиться от недостатков предыдущего метода, связанных с большими затратами времени, необходимого для "установления равновесия. С помощью этого метода можно определять молекулярные веса, когда центрифугируемый раствор находится в состоянии приближения к равновесию. Вначале макромолекулы распределяются по всему объему аналитической ячейки равномерно; затем по мере центрифугирования молекулы оседают, и плотность раствора в области мениска постепенно уменьшается. Изменение плотности тщательно регистрируют, а затем путем сложных расчетов, включающих большое число переменных, определяют молекулярный вес данного соединения по формулам:

где R -- газовая постоянная, Т -- абсолютная температура, v -- парциальный удельный объем, р -- плотность растворителя, dcldr -- градиент концентрации макромолекулы, г м и г д -- расстояние до мениска и дна пробирки соответственно, с м и с д -- концентрация макромолекул у мениска и у дна пробирки соответственно, М м и M R --величины молекулярных весов, определенные по распределению концентрации вещества у мениска и дна пробирки соответственно.

2.8.2 Оценка чистоты препаратов

Аналитическое ультрацентрифугирование широко применяется для оценки чистоты препаратов ДНК, вирусов и белков. Чистота препаратов несомненно очень важна в тех случаях, когда требуется точно определить молекулярный вес молекулы. В большинстве случаев о гомогенности препарата можно судить по характеру границы седиментации, используя метод определения скорости седиментации: гомогенный препарат обычно дает одну резкоочерченную границу. Присутствующие в препарате примеси проявляются в виде дополнительного пика или плеча; они же обусловливают асимметрию основного пика.

2.8.3 Исследование конформационных изменений в макромолекулах

Еще одна область применения аналитического ультрацентрифугирования -- исследование конформационных изменений макромолекул. Молекула ДНК, например, может быть одно- или двухцепочечной, линейной или кольцевой. Под действием различных соединений или при повышенных температурах ДНК претерпевает ряд обратимых и необратимых конформационных изменений, которые можно установить по изменению скорости седиментации образца. Чем компактнее молекула, тем меньше ее коэффициент трения в растворе и наоборот: чем менее она компактна, тем больше коэффициент трения и, следовательно, тем медленнее будет она седиментировать. Таким образом, различия в скорости седиментации образца до и после различных воздействий на него позволяют обнаруживать конформационные изменения, происходящие в макромолекулах.

У аллостерических белков, таких, например, как аспартат-транскарбамоилаза, конформационные изменения возникают в результате связывания их с субстратом и малыми лигандами. Диссоциацию белка на субъединицы можно вызывать, обработав его такими веществами, как мочевина или парахлормеркурибензоат. Все эти изменения легко можно проследить при помощи аналитического ультрацентрифугирования.

Подобные документы

    Особенности строения и роста растительных клеток. Методы изучения растительной клетки. Электронная микроскопия, возможности светового микроскопа. Метод замораживания-скалывания. Дифференциальное центрифугирование, фракционирование. Метод культуры клеток.

    реферат , добавлен 04.06.2010

    Выделение цереброзидов и сульфатидов головного мозга. Количественное определение фракций по углеводному компоненту. Удельная радиоактивность отдельных фракций цереброзидов и сульфатидов. Препаративное получение сфингозина. Метод периодатного окисления.

    доклад , добавлен 25.10.2014

    Основные механизмы деятельности клетки. Клетка как единица физиологических процессов обмена. Основные представления о регуляции. Функции клеточных органелл, мембранные системы внутриклеточных органелл. Обмен веществами между клеткой и окружающей средой.

    презентация , добавлен 04.02.2016

    Синтез белка Xvent-2 в клетках зародышей с целью дальнейшей дифференцировки стволовых клеток. Выделение клеточных органелл. Реагенты и растворы для изоэлектрического фокусирования. Получение биологического материала. Результаты работы и их обсуждение.

    курсовая работа , добавлен 27.06.2015

    Положение ситниковых в типологической классификации. Отличительные признаки покрытосеменных. Особенности строения клеток, тканей и субклеточных структур. Местообитание семейства ситниковых и особенности размножения. Самый крупный род семейства.

    курсовая работа , добавлен 10.10.2012

    Вещества, задерживающие прорастание из плодов и семян и их роль в расселении растений. Корневые выделения и их роль в аллелопатии. Природа аллелапатически активных веществ. Физиологическое и биохимическое действие аллелопатически активных веществ.

    реферат , добавлен 25.02.2016

    Ткань - частная система органа, состоящая из клеток и внеклеточных элементов с общей эпигеномной наследственностью. Эмбриональный гистогенез: детерминация, пролиферация, дифференциация, интеграция и адаптация клеточных систем. Общая классификация тканей.

    реферат , добавлен 23.12.2012

    Описание основных функций, выполняемых процессами выделения веществ у растений. Понятие аллелопатии, экскреции и секреции. Функции специализированных секреторных структур у растений. Группы эпидермальных образований, участвующих в выделении веществ.

    презентация , добавлен 15.03.2011

    Класификация тканей, виды эпителиальных тканей, их строение и функции. Опорная, трофическая и защитная функция соединительных тканей. Функции нервной и мышечной тканей. Понятие об органах и системах органов, их индивидуальные, половые, возрастные отличия.

    реферат , добавлен 11.09.2009

    История систематического изучения закономерностей эволюции тканей. Теория параллелизма гистологических структур. Теория дивергентной эволюции тканей. Теория филэмбриогенеза в гистологии. Эпителиальная, производные мезенхимы, мышечная и нервная ткань.

Дифференциальное центрифугирование

В случае дифференциального центрифугирования образцы центрифугируют определенное время при заданной скорости, после чего удаляют надосадочную жидкость. Этот метод полезен для разделения частиц, сильно различающихся по скорости седиментации. Например, центрифугирование в течение 5--10 мин при 3000-- 5000 д приводит к осаждению интактных бактериальных клеток, тогда как большинство клеточных фрагментов при этом остается в надосадочной жидкости. Фрагменты клеточной стенки и большие мембранные структуры можно осадить центрифугированием при 20 000--50 000 § в течение 20 мин, в то время как маленькие мембранные везикулы и рибосомы требуют для осаждения центрифугирования при 200 000 § в течение 1 ч.

Зональное центрифугирование

Зональное центрифугирование представляет собой эффективный способ разделения структур, имеющих сходную плавучую плотность, но различающихся по форме и массе частиц. В качестве примеров можно привести разделение субъединиц рибосом, различных классов полисом, а также молекул ДНК, имеющих различную форму. Центрифугирование осуществляют либо в бакет-роторах, либо в специально устроенных зональных роторах; для предотвращения конвекции при центрифугировании в стаканах бакет-ротора или в камере зонального ротора создают слабый градиент (обычно сахарозы). Пробу наносят в виде зоны или узкой полосы в самом верху градиентного столбика. Для субклеточных частиц обычно используется градиент сахарозы от 15 до 40% (вес/объем).

Что такое центрифугирование? Для чего применяется метод? Термин "центрифугирование" означает разделение жидких либо твердых частиц вещества на различные фракции с помощью центробежных сил. Осуществляется такая сепарация субстанций благодаря использованию специальных аппаратов - центрифуг. В чем же заключается принцип метода?

Принцип центрифугирования

Рассмотрим более детально определение. Центрифугирование - это воздействие на вещества путем сверхскоростного вращения в специализированном аппарате. Главной частью любой центрифуги выступает ротор, который содержит гнезда для установки пробирок с материалом, что подлежит сепарации на отдельные фракции. Во время вращения ротора на повышенных скоростях в действие вступает Вещества, помещенные в пробирки, разделяются на различные субстанции согласно уровню плотности. Например, при центрифугировании образцов подземных вод отделяется жидкость и осаждаются содержащиеся в ней твердые частицы.

Автор метода

Впервые стало известно, что такое центрифугирование, после опытов, проведенных ученым А. Ф. Лебедевым. Метод был разработан исследователем с целью определения состава почвенных вод. Ранее в данных целях использовали отстаивание жидкости с последующим отделением от нее твердых образцов. Разработка метода центрифугирования позволила справляться с этой задачей гораздо быстрее. Благодаря такой сепарации возникла возможность для извлечения твердой доли веществ из жидкости в сухом виде на протяжении считаных минут.

Этапы центрифугирования

Дифференциальное центрифугирование начинается с отстаивания веществ, что подлежат исследованию. Такая обработка материала происходит в аппаратах-отстойниках. В ходе отстаивания частицы вещества разделяются под воздействием гравитации. Это позволяет подготовить субстанции к более качественной сепарации с помощью центробежных сил.

Далее вещества в пробирках подвергаются фильтрации. На этом этапе применяются так называемые перфорированные барабаны, что предназначаются для отделения жидких частиц от твердых. В ходе представленных мероприятий весь осадок остается на стенках центрифуги.

Преимущества метода

По сравнению с прочими методами, направленными на разделение отдельных субстанций, такими как фильтрование или отстаивание, центрифугирование дает возможность получать осадок с минимальным показателем влажности. Применение такого способа сепарации позволяет разделять тонкодисперсные суспензии. Результатом становится получение частиц размером в 5-10 мкм. Еще одним важным преимуществом центрифугирования выступает возможность его выполнения при помощи аппаратуры малых объемов и габаритов. Единственным недостатком метода выступает высокая энергоемкость приборов.

Центрифугирование в биологии

В биологии к сепарации веществ на отдельные субстанции прибегают при необходимости подготовки препаратов для исследования под микроскопом. Центрифугирование здесь производится на сложных устройствах - цитороторах. Такие аппараты помимо слотов для пробирок комплектуются держателями образцов, всевозможными предметными стеклами непростой конструкции. От устройства центрифуги при проведении исследований в биологии напрямую зависит качество получаемых материалов и, соответственно, количество полезной информации, которую можно почерпнуть из результатов анализа.

Центрифугирование в нефтеперерабатывающей промышленности

Метод центрифугирования незаменим при добыче нефти. Существуют углеводородные ископаемые, из которых не полностью выделяется вода при дистилляции. Центрифугирование дает возможность убрать лишнюю жидкость из состава нефти, повысив ее качество. В данном случае нефть растворяют в бензоле, затем нагревают до 60 о С, а затем подвергают воздействию центробежной силы. В завершение замеряют количество оставшейся воды в веществе и при необходимости повторяют процедуру.

Центрифугирование крови

Этот метод широко применяется для лечебных целей. В медицине он позволяет решать следующий ряд задач:

  1. Получение очищенных образцов крови для проведения плазмафереза. В данных целях в центрифуге отделяют форменные элементы крови от ее плазмы. Операция дает возможность избавить кровь от вирусов, избыточных антител, болезнетворных бактерий, токсинов.
  2. Подготовка крови для донорского переливания. После разделения телесной жидкости на отдельные фракции при помощи центрифугирования донору возвращают клетки крови, а плазма применяется для переливания либо замораживается в целях последующего использования.
  3. Выделение тромбоцитарной массы. Субстанцию получают из Полученную массу используют в хирургических и гематологических отделениях медицинских учреждений, в неотложной терапии, операционных. Применение тромбоцитарной массы в медицине дает возможность улучшить свертываемость крови у пострадавших.
  4. Синтез эритроцитарной массы. Центрифугирование клеток крови происходит путем деликатной сепарации ее фракций согласно специальной методике. Готовую массу, богатую эритроцитами, используют для переливания при кровопотерях, операциях. Эритроцитарная масса нередко применяется в целях лечения анемии, прочих заболеваний крови системного характера.

В современной медицинской практике применяется немало приборов нового поколения, которые дают возможность разгонять вращающийся барабан до определенной скорости и останавливать его в определенный момент. Это позволяет более точно разделять кровь на эритроциты, тромбоциты, плазму, сыворотку и сгустки. Аналогичным способом исследуются прочие телесные жидкости, в частности сепарируются вещества в составе мочи.

Центрифуги: основные типы

Мы разобрались, что такое центрифугирование. Теперь давайте выясним, какие аппараты применяются для реализации метода. Центрифуги бывают закрытыми и открытыми, с механическим или ручным приводом. Основной рабочей частью ручных открытых приборов выступает вращающаяся ось, расположенная вертикально. В ее верхней части перпендикулярно закреплена планка, где располагаются подвижные металлические гильзы. В них помещаются специальные пробирки, зауженные в нижней части. На дно гильз укладывают вату, что позволяет избежать повреждения стеклянной пробирки при соприкосновении с металлом. Далее аппарат приводят в движение. По истечении некоторого времени происходит отделение жидкости от твердых взвешенных частиц. После этого ручную центрифугу останавливают. На дне пробирок концентрируется плотный, твердый осадок. Над ним находится жидкая часть вещества.

Механические центрифуги закрытого типа обладают большим количеством гильз для размещения пробирок. Такие приборы более удобны по сравнению с ручными. Их роторы приводятся в движение мощными электромоторами и способны разгоняться до 3000 оборотов в минуту. Это дает возможность осуществлять более качественную сепарацию жидких субстанций от твердых.

Особенности подготовки пробирок при центрифугировании

Пробирки, что применяются для центрифугирования, должны быть наполнены исследуемым материалом идентичной массы. Поэтому для измерений здесь применяются специальные высокоточные весы. Когда требуется уравновешивание многочисленных пробирок в центрифуге, прибегают к следующему приему. Взвесив пару стеклянных емкостей и добившись одинаковой массы, одну из них оставляют в качестве эталона. Последующие пробирки уравновешивают с этим образцом, прежде чем поместить в аппарат. Такой прием существенно ускоряет работу при необходимости подготовки к центрифугированию целой серии пробирок.

Стоит заметить, что в пробирки никогда не помещают слишком много исследуемой субстанции. Стеклянные емкости наполняют таким образом, чтобы расстояние до края составляло не менее 10 мм. Иначе вещество будет выливаться из пробирки под воздействием центробежной силы.

Сверхцентрифуги

Для разделения составляющих чрезвычайно тонких суспензий недостаточно применения обычных ручных либо механических центрифуг. В данном случае требуется более внушительное воздействие на вещества со стороны центробежных сил. При реализации таких процессов применяются сверхцентрифуги.

Аппараты представленного плана оснащаются глухим барабаном в виде трубки незначительного диаметра - не более 240 мм. Длина такого барабана значительно превышает его сечение, что дает возможность в значительной степени повысить количество оборотов и создать мощнейшую центробежную силу.

В сверхцентрифуге исследуемое вещество поступает внутрь барабана, движется по трубке и ударяется о специальные отражатели, что отбрасывают материал на стенки прибора. Здесь же имеются камеры, предназначенные для раздельного вывода легких и тяжелых жидкостей.

К достоинствам сверхцентрифуг относятся:

  • абсолютная герметичность;
  • высочайшая интенсивность сепарации веществ;
  • компактные размеры;
  • возможность разделения субстанций на молекулярном уровне.

В заключение

Вот мы и выяснили, что такое центрифугирование. В настоящее время метод находит свое применение при необходимости выделения осадков растворов, очищения жидкостей, разделения компонентов биологически активных и химических веществ. Для сепарации субстанций на молекулярном уровне применяются ультрацентрифуги. Метод центрифугирования активно используется в химической, нефтяной, атомной, пищевой промышленности, а также в медицине.